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| Journal of Forensic Medicine, October 2017, Vol.33, No.5 |
| 日期：2020/9/6 浏览次数：452 |
| Journal of Forensic Medicine, October 2017, Vol.33, No.5
RT-qPCR 技术在法医病理学研究中的应用
杜思昊，李冬日，王慧君，王起
（南方医科大学法医学院，广东广州510515）
摘要： 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription quantitative real-time polymerase chain
reaction，RT-qPCR）是一种易操作且高效率检测组织或体液样本中mRNA 的方法，具有操作容易、敏感性
高、特异性强等特点。随着其在医学、生物学等领域的广泛应用，RT-qPCR 技术在法医病理学领域的研究也
得到一定发展。本文对RT-qPCR 技术在法医病理学科研工作中的应用价值及现状进行综述，对国内外研
究进展进行了回顾，并总结了实验过程中的检材提取、RT-qPCR 实验及数据处理的注意事项，以期为法医
学研究及应用提供参考。
关键词： 法医病理学；逆转录聚合酶链反应；综述；实时荧光定量
中图分类号： DF795.2 文献标志码： A doi： 10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.017
文章编号： 1004-5619（2017）05-0526-06
Application of RT-qPCR in the Study of Forensic Pathology
DU Si-hao, LI Dong-ri, WANG Hui-jun, WANG Qi
（School of Forensic Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China）
Abstract： Reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-qPCR） is a convenient
and highly efficient method for the detection of mRNA in tissues or body fluid samples. It has the
characteristics of easy operation, high sensitivity and specificity, etc. With a wide application in medicine,
biology and other fields, RT-qPCR technique has made some progresses in the research field of forensic
pathology. This paper reviews the application value of RT-qPCR in the study of forensic pathology and
current situation, as well as the research progress at home and abroad reviews. It also summarizes the
notes of samples extraction, RT-qPCR experiments and data processing, which aims to provide reference
for the forensic research and its application.
Keywords： forensic pathology; reverse transcriptase polymerase chain reaction; review; real-time quantification
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81401556）；广东省自
然科学基金资助项目（2014A030310293）
作者简介：杜思昊（1992—），男，博士，主要从事法医病理学科
研、鉴定；E-mail：sihaodu@foxmail.com
通信作者：王起，男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事
法医学教学、科研和鉴定；E-mail：wangqi_legmed@126.com
实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse
transcription quantitative real-time polymerase chain
reaction，RT-qPCR）是一项能高通量、高效率检测目
的基因表达水平的技术。RT-qPCR 的主要操作步骤
包括总RNA 的提取、质量检查、逆转录、定量PCR
及数据分析，其主要原理即在逆转录酶的作用下以
mRNA 为模板合成cDNA 的一条链，接着在DNA 聚
合酶的作用下进行扩增，期间通过qPCR 仪检测荧光
信号的变化情况并测定目的产物的含量，再根据标准
曲线计算mRNA 的含量或与内参基因含量比较后计
算相对含量[1]。RT-qPCR 技术于1992 年由日本科学
家Higuchi 提出[2]，因其具有操作简便、效率高、特异
性强等优点，目前被广泛应用在医学、生物学等多个
领域中。
根据经典遗传学中心法则，控制生物遗传信息的
DNA 分子需要经过转录形成mRNA、翻译成多肽链，
再进一步修饰成为有生物活性的蛋白质，因此mRNA
的变化早于蛋白的表达变化。目前，RT-qPCR 技术在
法医病理学科研方面也获得了一定发展。
1 RT-qPCR 技术在法医病理学工作中
的应用价值与现状
法医病理学是研究与法律有关的伤、病、死及死
后变化的发生发展规律的一门学科[3]。其主要工作内
·综述·
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容即对尸体及器官组织进行检验，分析死亡原因，为
案件的侦破提供医学证据。其需要解决的问题包括确
定死亡原因、判断死亡方式、推断死亡时间、推断损伤
时间、推断和认定致伤物以及个体识别等。当前法医
病理工作者解决上述问题主要依靠的方法手段是现
场勘验、尸体检验、组织病理学检验、毒（药）物检验
等，并综合案情分析得出鉴定意见。而一些致伤因素
（如中暑、冻死、中毒）导致的死亡或缺乏典型形态学
改变的疾病（如急性心肌缺血、内分泌系统等）导致猝
死的鉴定，仅利用传统的法医病理学方法进行鉴定相
对困难。因此，近年来国内外学者将分子生物学技术
应用到法医病理学工作与研究中，利用法医尸体解剖
时提取的组织和体液等进行RT-qPCR 检测来协助分
析死亡原因、推断死亡时间、损伤时间等，RT-qPCR
技术正逐渐成为目前法医病理学研究的热点之一。
1.1 RT-qPCR 技术在死亡原因分析中的应用
法医病理学的首要任务即确定死亡原因，而在一
些缺乏特异性形态学改变的死亡案件中，若缺乏相关
案情资料，传统的法医病理学检查方法有时难以发现
特征性改变[3]。如在急性心肌缺血导致死亡的鉴定中，
因缺乏典型的组织病理学改变，往往给诊断带来困难。
XUE 等[4]检测心肌中Cx43 和ZO1 的mRNA 表达变
化，结果显示，冠心病猝死组与对照组相比，Cx43 和
ZO1 的mRNA 表达明显降低，提示心脏性猝死者可能
发生心律失常。WANG 等[5]检测肺组织中水通道蛋白-1
（aquaporin-1，AQP-1）和AQP-5 的mRNA 表达变化，
发现AQP-5 在窒息组中显著降低，此改变可能因窒息
过程中缺氧引起，有助于对窒息死亡案件进行鉴定。
由于不同案件的死亡原因、机制和过程各不相
同，机体组织中分子水平变化也会随之改变，而常规
组织病理学检验难以发现这些改变，因此检测相关
mRNA 的变化可以反映死亡机制和过程，辅助进行死
亡原因推断。
1.2 RT-qPCR 技术在推断死亡时间中的应用
死亡时间也称死后间隔时间（postmortem interval，
PMI）。法医学中推断死亡时间具有十分重要的意义，
对于分析案情、划定侦查范围、判断嫌疑人作案时间
均有重要价值。但是，实际工作中受个体差异、周围环
境、死后变化等各因素的影响，准确推断死亡时间仍
是法医病理学的难点。国内学者[6-8]用RT-qPCR 技术
检测死后不同时间大鼠的脑和脾等器官中管家基因
GAPDH 及β-actin mRNA 的水平变化，测定了管家
基因在推断死亡时间中的变化情况，并检测了不同环
境温度及湿度下mRNA 降解的时序性，为死亡时间
的推断提供了重要数据。他们的研究提示，采用管家
基因作为推断死亡时间的研究对象，可以避免选用其
他基因带来的个体差异，并且在脑、脾组织中GAPDH
及β-actin mRNA 稳定性较好，可有效地用于晚期
PMI 的推断。吕叶辉等[9]选取12 例已知死亡时间的尸
体脑组织，通过RT-qPCR 技术检测8 种基因mRNA
表达，结果显示，利用β-actin mRNA 表达推断PMI
的误差率为24.6%，利用GAPDH mRNA 表达推断
PMI 的误差率为41.0%。因此，β-actin mRNA 变化与
死亡时间相关性良好，有望成为早期PMI 推断的辅
助指标。
1.3 RT-qPCR 技术在推断损伤时间中的应用
法医病理学上的损伤时间是指从受伤到死亡所
经历的时间，推断损伤时间是法医病理学工作的难点
与重点，传统的推断方法主要是依据损伤组织的大体
形态和组织病理学改变。通过多种分子生物学技术，
可以对损伤修复过程中特征性的分子水平变化进行
研究。例如，在烧伤[10]和切创[11]的损伤时间确定上，均
采用RT-qPCR 技术检测皮肤内的细胞因子、趋化因
子等标志物。在虐童案件中，皮肤烧伤时间的确定至
关重要，KUBO 等[10]研究了烧伤后伤口愈合过程中
13 个基因表达的时间变化，发现细胞因子、趋化因
子、增殖因子及胶原蛋白等组合能准确估计烧伤年
龄。兔的切创模型中，白介素1β（interleukin-1β，IL-
1β）、环氧合酶（cyclooxygenase，COX） 2 及单核细胞
趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）
mRNA 在损伤前期有明显升高，有助于切创早期的时
间推断[11]。国内有学者[12-13]制作大鼠骨骼肌挫伤模型，
用RT-qPCR 技术检测骨骼肌中7 种候选基因在不同
时间点的mRNA 表达水平，显示其表达水平均与损
伤时间有关；检测挫伤组织中兴奋性氨基酸转运体3
（excitatory amino acid transporter 3，EAAT3）、SLC1A1
mRNA 的表达，发现其表达在挫伤后4~8 h 升高，随
后逐渐降低，直至48 h 接近正常水平，说明编码结构
蛋白的基因或执行基础功能的蛋白适用于损伤时
间推断。有研究[14-17]发现，大鼠肌肉挫伤后组织内核
因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、细胞间黏附因
子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、
COX6C、腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，
ASL）的表达呈时序性变化，有望用于损伤时间推断。
用RT-qPCR 技术检测大鼠脑挫伤模型mRNA 的表
达变化特点，发现caspase-1 和caspase-3 在挫伤后表
达增加，可辅助诊断1 h~14 d 的脑挫伤，而NF-κB 只
能辅助确定脑挫伤形成时间，但不能作为判断脑挫伤
程度的指标[18-20]。用RT-qPCR 技术检测小鼠皮肤切
创组织的CB2R mRNA 变化特点，结果发现在小鼠皮
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肤切创愈合过程中CB2R 的表达变化具有时间规律
性，可为皮肤损伤时间的推断提供参考[21-22]。除切创、
挫伤外，也有学者[23-25]对脊髓损伤和脑组织缺血模
型应用RT-qPCR 技术检测目的基因的变化，发现
脊髓损伤后缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor-
1α，HIF-1α）基因表达开始升高，对组织和细胞起低
氧保护作用。而脑组织缺血后脑红蛋白（neuroglobin，
Ngb） mRNA 的表达也呈时间依赖性变化，其表达的
时序性规律有望用于法医学损伤时间推断。但上述研
究主要集中在动物模型，人体组织的验证较少，其法
医学价值尚需进一步挖掘。
1.4 RT-qPCR 技术在推断死亡过程机体病理生理
状态中的应用
死亡的过程和机制是法医病理学研究的难点，利
用RT-qPCR 技术分析尸体组织样本的mRNA 变化
来分析死亡当时的相关分子水平情况，从而有助于推
断死亡当时的病理生理学状态。RT-qPCR 技术可应
用于组织损伤的病理学分析、局部缺血缺氧、中毒或
因中毒导致组织损伤部位的炎症、对暴力或环境危害
的反应、中毒继发的疾病等分析[26]。例如，CHEN 等[27]
发现死后肺质量与生存时间相关；ZHAO 等[28]通过
RT-qPCR 技术研究发现死后肺组织中葡萄糖转运体1
（glucose transporter 1，GLUT1）和血管内皮生长因子
（vascular endothelial growth factor，VEGF） mRNA 表
达量与存活时间相关，部分说明了死亡当时肺的病理
生理学状态。WANG 等[29]利用RT-qPCR 技术对肺水
肿机制进行研究，发现中暑死亡者的肺组织中基质金
属蛋白（matrix metallo protein，MMP）、ICAM-1、紧密
连接蛋白（claudin，Cldn） 5 的表达均升高，而冻死者
肺中只有MMP9 的表达升高，提示细胞外基质破坏、
炎症反应、紧密连接改变等多种机制参与中暑死亡者
肺水肿的发生和发展，而这些分子的变化情况也有助
于中暑死亡的辅助诊断。
WANG 等[30]研究损伤与肺水肿的关系，发现AQP
与MMP 的mRNA 变化情况在外伤与心脏性猝死组
的肺组织中有明显不同，提示不同类型外伤后肺水肿
的发生和发展机制有差别；他们还研究了烧死者脑水
肿的机制，发现AQP 与MMP 的mRNA 变化情况与
烧伤后脑水肿的发生也存在关系。CHEN 等[31]用RTqPCR
技术检测急性心肌缺血心脏组织中脑钠肽
（brain natriuretic peptide，BNP）与心房钠尿肽（atrial
natriuretic peptide，ANP）的含量变化，结果发现心脏
死亡组左心室壁组织中ANP 和（或） BNP mRNA 的表
达更高，显示心肌钠尿肽在心肌缺血死亡中的病理生
理反应特点。因此，检测不同基因mRNA 的表达水
平，一方面可以用于分析死亡原因，另一方面也有助
于加深法医病理学工作者对死亡过程的理解。
但是RT-qPCR 技术在法医病理学中应用依然存
在局限性，目前其准确程度尚需进一步验证。RTqPCR
技术对样品要求比较高，但法医病理学尸体检
材往往都存在不同程度的自溶，这也是国内外使用
RT-qPCR 技术进行研究的对象主要集中于动物模型
组织的原因，然而动物模型并不能完全代表人体组织
检材的特点，因此针对RT-qPCR 实验的各环节，法医
病理学研究有其特殊需要注意的事项。
2 RT-qPCR 技术在法医病理学中应用
的注意事项
法医病理学检材由于受死后变化、个体差异、潜
在疾病等因素的影响明显，在应用RT-qPCR 技术时
需要特别注意以下问题。
2.1 RT-qPCR 技术对检材提取的要求
法医病理学鉴定材料主要是尸体组织样本，尸体
腐败导致mRNA 降解。任广睦等[8]对死后不同时间段
大鼠脑组织中的GAPDH mRNA 进行检测，显示不同
脑区神经组织的GAPDH mRNA 表达均与死后经过
时间（死后即刻、1 d、5 d、9 d、12 d）有相关性；但不同
脑区的mRNA 降解速率不同。人体和动物试验可能
存在差异，吕叶辉等[9]对早期死亡的人体脑组织内参
基因的RNA 进行检测，显示5S rRNA、miR-9 和miR-
125b 等表达稳定，而GAPDH 的误差率较高，可能与
死后变化有关。VAN DEN BERGE 等[32]对81 例埋藏
4~42 年的尸体进行不同器官的DNA 与RNA 分析，
发现DNA 和RNA 分子均能够保持较稳定的状态，其
中大脑和心脏组织中RNA 最为稳定，这一结果表明，
即使是埋藏时间较长的尸体，也有可能进行分子病理
学分析。
提取检材时应考虑后期检测的需要，尽量多留取。
选取对照组时应注意详细审查案情及病历资料，选取
无潜在疾病或药物干扰的案例。解剖中提取检材应使
用洁净、无污染的器械，提取目标组织样本，大小不超
过0.5 cm×0.5 cm，需要加入适量组织保存液进行RNA
保护[33]。目前常用的组织保存液为RNA later，研究表
明RNA later 具有更好的保护作用，优于冷冻法[33]。
2.2 尸体检材进行RT-qPCR 实验的注意事项
从检材中提取出高纯度、完整的RNA 是RTqPCR
的前提。最常用的RNA 提取方法包括Trizol 抽
提加乙醇沉淀法和试剂盒硅胶膜离心柱法[34-35]。Trizol
抽提加乙醇沉淀法可以保留比较完整的RNA 分子，
但是步骤繁多，容易污染，影响纯度；试剂盒硅胶膜离
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心柱法往往只能留存大分子量的RNA，200 nt 以下的
小分子量RNA 容易被漏掉[36]。提取RNA 最重要的指
标包括浓度、纯度和完整度[37]。浓度、纯度的控制均按
照RT-qPCR 实验的常规要求；而RNA 分子完整性指
对RNA 进行毛细管电泳时，以软件中的RNA 完整性
计数（RNA integrity number，RIN）进行评估[37]。在尸
体组织样本中，RIN 往往较低，由于RT-qPCR 实验十
分灵敏，有少量合格的RNA 也可以检出。
目前最常用于mRNA 检测的荧光技术是SYBR誖
Green I 和TaqMan誖探针[38-39]。SYBR誖Green I 探针
需要进行引物设计、合成、摸索PCR 条件等，比较经
济实惠；TaqMan誖探针操作条件均已得到优化，简
便易行，且结果稳定，但价格较贵。在使用SYBR誖
Green I 法进行检测时，还需要注意溶解曲线的意义
及形状。
2.3 数据分析
比较检材中mRNA 的表达差异有绝对定量与相
对定量两种方法。绝对定量即仅依赖Ct 值，不考虑扩
增效率对结果的影响。有研究[40-41]发现，不同样本的
RNA 组成不同，个体的逆转录抑制物差异造成扩增
效率不足100%，因此应慎重使用绝对定量。相对定
量即使用内参基因使结果标准化，从而消除非生物学
变化对结果的影响。但传统的内参基因并不一定适用
于所有的实验条件，KOPPELKAMM 等[42]的研究指出，
人体死后组织的内参基因建议至少选择4 个以供筛
选。WANG 等[43]对几种不同内参在尸体材料中表达的
情况做过相关研究，结果发现，实验中传统内参基因
在法医病理学研究中并不完全适用，须使用多个内参
基因以提高数据分析的准确性。在一项烧伤后脑水肿
的分子病理学研究[29]中，使用不同的内参基因进行相
对定量，结果发现，当使用GAPDH 或B2M 作为内参
时，AQP 和MMP 的mRNA 水平在烧伤组与对照组中
有不同的结果。XUE 等[4]研究发现，选用传统的管家
基因GAPDH 或ACTB 与多选择的几个管家基因
（EEF1A1、PPIA、TPT1 和RPL13A）对心肌组织目的基
因进行相对定量的结果也不同。DU 等[44]在对甲基苯
丙胺中毒死亡尸体组织进行研究，检测了脑中不同内
参基因的稳定性，结果RPL13A、YWHAZ 和GUSB 用
于肺组织的内参定量更为稳定。因此，尸体检材用于
RT-qPCR 时，应对不同的器官组织进行内参基因的
筛选，避免单个内参基因造成的相对定量误差，考虑
到时间和效率，建议选取3~4 个内参基因为宜。
准确定量mRNA 的表达丰度不仅需要高灵敏性
的检测方法，而且还需要精确的数据分析方法。内参
的选择对目的基因的表达矫正具有重要意义。
3 RT-qPCR 技术应用前景及展望
当前国内外法医病理学者使用RT-qPCR 技术主
要应用领域依然是mRNA 的表达分析，近年来也有
学者开始利用RT-qPCR 技术检测非编码RNA（noncoding
RNA，ncRNA）。李文灿等[45]检测了大鼠心肌组
织中的microRNA、18S rRNA 的降解和死亡时间的相
关性，发现microRNA 可能与尸体腐败导致的降解相
关，但在死亡早期（死后120 h）内microRNA-1-2 含
量保持稳定，提示死亡早期可以作为一个稳定的内参
指标反映其他生物学标志物的变化。陈维忠[46]研究了
创伤性脑损伤后，大鼠海马组织microRNA 的表达变
化与认知功能障碍的相关性，结果伤后海马microRNA
表达与P300 变化存在一定相关性，microRNA 可能在
脑损伤后遗留的认知功能障碍中发挥调控作用。有报
道[47-50]发现，不同体液中microRNA 的表达特异性也
有差异，但是研究体液中microRNA 的数量有限，而且
采用不同的检测方法和分析模型，导致研究的结果不
一致，重复性差。这些问题可以通过建立复合检测体系
来解决。随着RT-qPCR 技术的推广，相信未来mRNA
和ncRNA 在法医病理学中的应用会更加广泛。
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（收稿日期：2016-11-07）
（本文编辑：黄平）
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