Journal of Forensic Medicine, April 2019, Vol.35, No.2 损伤时间推断是法医病理学的难点问题之一，其 研究方法主要包括形态学、分子生物学等，其中形态 学方法具有确凿、稳定、直观可视化等优点。形态分 析技术的不断发展，阳性识别和计数，面积分析以及 距离分析等功能的丰富，使得形态学分析（包括 HE 染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色及针对特定 细胞的特殊染色等）进行骨骼肌损伤时间推断的研究 有了更广阔的前景。 基金项目：国家自然科学基金面上基金资助项目（81571852，81373241）；国家自然科学基金青年科学基金资助项目（81601646） 作者简介：刘起清（1989—），男，硕士研究生，主要从事损伤病理学研究；E-mail：1060121847@qq.com 通信作者：孙俊红，男，博士，教授，主要从事损伤病理学和猝死病理学研究；E-mail：junhong.sun@sxmu.edu.cn 通信作者：王英元，男，教授，主要从事损伤病理学和猝死病理学研究；E-mail：wyy580218@163.com 应用中性粒细胞迁移距离推断损伤时间 刘起清1 ，郭红民2 ，王磊1 ，鲁翰霖1 ，杜秋香1 ，百茹峰3 ，孙俊红1 ，王英元1 （1. 山西医科大学法医学院，山西 太原 030001；2. 太原市公安局迎泽分局，山西 太原 030002；3. 中国 政法大学刑事司法学院，北京 100040） 摘 要：目的 探索中性粒细胞迁移距离在大鼠骨骼肌损伤时间推断中的应用，为后续损伤时间推断研究 提供方法学依据。 方法 建立大鼠骨骼肌挫伤模型，设置对照组和损伤后2、4、6 h组，采用免疫组织化学 染色技术检测损伤后中性粒细胞参与炎症的反应规律，运用TissueFAXS PLUS 软件检测中性粒细胞的迁 移距离，并探讨其与损伤时间的关系。 结果 骨骼肌损伤后2~6 h中性粒细胞浸润明显，伤后2 h中性粒细 胞阳性率为（28.75±0.94）%，伤后4 h达到峰值［（45.50±3.63）%］，伤后6 h下降为（31.92±1.56）%。中性粒细 胞迁移距离随炎症进展逐渐增大，伤后 2、4、6 h 分别为（124.80±12.32）μm、（229.03±21.45）μm、（335.04± 16.75）μm。 结论 骨骼肌损伤后2~6 h，中性粒细胞的数量及迁移距离与损伤时间之间存在相关性，有望 用于骨骼肌早期损伤时间推断。 关键词：法医病理学；创伤和损伤；细胞迁移分析；中性粒细胞；骨骼肌；损伤时间推断；大鼠 中图分类号：DF795.1 文献标志码：A doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2019.02.007 文章编号：1004-5619（2019）02-0166-05 Wound Age Estimation by Neutrophil Migration Distance LIU Qi-qing1 , GUO Hong-min2 , WANG Lei 1 , LU Han-lin1 , DU Qiu-xiang1 , BAI Ru-feng3,4 , SUN Junhong1 , WANG Ying-yuan1 （1. School of Forensic Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2. Yingze Branch of Taiyuan Public Security Bureau, Taiyuan 030002, China; 3. School of Criminal Justice, China University of Political Science, Beijing 100040, China） Abstract：Objective To explore the application of neutrophil migration distance for wound age estimation of skeletal muscles in rats, and to provide methodological basis for follow- up study in future. Methods The skeletal muscle contusion model was established in rats, and the control group and the 2, 4, 6 h post-traumatic groups were set. The law of response of neutrophils that participated in the inflammation after injury was detected by immunohistochemical staining, and the relationship between neutrophil migration distance and injury time was detected by TissueFAXS PLUS software. Results The skeletal muscle was obviously infiltrated with neutrophils 2-6 h after injury. The positive rate of neutrophil was （28.75±0.94）% at 2 h post-traumatic, and reached the peak（45.50±3.63）% at 4 h posttraumatic, then decreased to （31.92±1.56）% at 6 h post-traumatic. The neutrophil migration distances increased with the progress of inflammation, and reached （124.80±12.32）μm, （229.03±21.45）μm and （335.04±16.75）μm at 2 h, 4 h and 6 h, respectively. Conclusion There is a relationship of neutrophil infiltrated number and migration distance and wound age within the 2-6 h after skeletal muscle injury, which could be used for the inference of skeletal muscle wound age. Keywords：forensic pathology; wounds and injuries; cell migration assays; neutrophil; skeletal muscle; wound age estimation; rats ·论 著· ·损伤时间推断专题· · 166 · 万方数据法 医 学 杂 志 2019年 4月 第35卷 第2期 中性粒细胞是组织损伤后早期炎症阶段的重要参 与者。损伤早期，在受损部位炎症因子的趋化作用下， 中性粒细胞迅速浸润到损伤区，吞噬和清除坏死组织， 从而为损伤区组织修复和再生创造条件[1] 。因此，中 性粒细胞对于早期损伤时间推断具有重要研究价值。 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）由中性粒 细胞特异性合成和分泌，是中性粒细胞的特异性标志 物[2-3] 。目前中性粒细胞用于损伤时间推断的研究主 要集中在炎症细胞数量及比例的时序性变化规律[4] 。 本研究通过免疫组织化学染色技术标记 MPO 以 特异性识别中性粒细胞，对中性粒细胞在骨骼肌损伤 后的浸润过程进行定性、定位、定量分析，同时应用组 织细胞定量分析系统，检测中性粒细胞在早期炎症阶 段的迁移距离，并探讨迁移距离在骨骼肌损伤时间推 断中的应用价值。 1 材料与方法 1.1 仪器和试剂 自由落体肌肉挫伤装置[5-7] 。水合氯醛（天津科密 欧化学试剂有限公司），一抗为兔抗 MPO 多克隆抗体 （ab9535，英国 Abcam 公司），二抗使用即用型 SABCPOD（小鼠/兔 IgG）试剂盒（SA1020，武汉博士德生物 工程有限公司），金属增强型二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒（AR1026，武汉博士德生 物工程有限公司），苏木素-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色试剂盒（AR1180，武汉博士德生物工程有限 公司），RM2135 石蜡切片机（德国 Leica 公司），TissueFAXS PLUS 免疫组织化学分析软件（奥地利 Tissue Gnostics 公司），4%多聚甲醛溶液、无水乙醇、二甲苯、 石蜡均为国产。 1.2 损伤模型制备 健康成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠 20 只（购自 北京海淀兴旺实验动物养殖场），体质量 180~220 g， 10~12 周龄。将大鼠随机分成对照组和损伤后 2、4、 6 h组，每组5只。损伤组用10%水合氯醛溶液腹腔注 射（0.35 mL/100 g）麻醉大鼠，运用500 g重力锤从30 cm 高的位置以自由落体方式砸击大鼠右后肢骨骼肌，打 击面积为 6.15 cm（2 r ≈1.40 cm），重力势能转化得到的 动能为1.5 J。对照组麻醉方式同损伤组，但不进行打 击[4-5] 。损伤后 2、4、6 h 再次以上述方式麻醉大鼠，生 理盐水心脏灌注，取挫伤处骨骼肌并观察其形态变化。 本动物实验方法已获山西医科大学科学研究伦 理审查委员会批准（伦理审批序号：2016LL151）。 1.3 免疫组织化学染色 将骨骼肌样本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h， 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡完毕后石蜡包埋制 成蜡块。使用 RM2135 石蜡切片机连续切片，厚度 3~ 5 μm，防脱片玻片铺片后 60 ℃过夜。组织切片常规 脱蜡至水，过氧化氢消除内源性酶，微波加热修复抗 原，5%小牛血清封闭，一抗 4 ℃过夜，即用型 SABCPOD 二抗孵育，滴加链霉抗生物素蛋白-生物素-过 氧化物酶复合物（streptavidin-biotin- peroxidase complex，SABC）液（二抗试剂盒内组分），DAB显色试剂盒 显色，HE染色试剂盒复染；梯度乙醇脱水、透明、封片。 1.4 筛选有效细胞核并计数中性粒细胞 利用 TissueFAXS PLUS 软件获取组织切片高清 图片。每个时间点5个样本，每个样本随机选取5张玻 片，在每张玻片的损伤区内随机选择 5 个 1 mm×1 mm 分析区，即得到 125 个样本数据。利用 TissueFAXS PLUS 软件以苏木素着色强度和着色面积作为参数识 别细胞核。实验中设置不同的核面积参数，逐步优化 细胞核识别数量，使肉眼可见的细胞核数量识别率达 95%以上，并以细胞核数量作为有效细胞核数量，有 效细胞核包括骨骼肌细胞核和中性粒细胞核（标识为 绿色）。同理，利用 TissueFSXS PLUS 软件以 DAB 显 色强度和着色面积作为参数识别中性粒细胞（标识为 红色）。根据上述结果，系统将自动计数测量区域内的 有效细胞核及中性粒细胞数并计算中性粒细胞比例。 1.5 中性粒细胞迁移距离测量 本研究提出基于组织切片计算中性粒细胞至最 邻近血管距离的“中性粒细胞迁移距离”简化模型，测 量中性粒细胞的平面平均迁移距离，而不考虑其到达 损伤区的中间路程。具体测量方法如下： 在选择的分析区内若只有一根血管，则以该血管 为原点，检测中性粒细胞与血管间的平面距离作为中 性粒细胞的平面距离。若损伤区内有多个血管，可利 用分析软件计算每个中性粒细胞分别距离这些血管 的平面距离，得到每个中性粒细胞的多个距离，此时 以最短距离作为该中性粒细胞的平面距离。最后计 算 5 个样本所有中性粒细胞的平均平面距离作为该 损伤时间点的推断特征。 1.6 统计学处理 采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析，利用单因素 方差分析比较各组中性粒细胞数及迁移距离的差 异。检验水准α=0.05。 2 结 果 2.1 大体观察及HE染色结果 对照组在解剖分离时肉眼可见骨骼肌和皮肤界 限较清晰、易分离；镜下见骨骼肌组织排列致密，肌细 · 167 · 万方数据Journal of Forensic Medicine, April 2019, Vol.35, No.2 胞为多核细胞，胞核位于胞膜下，胞质着色鲜红。与 对照组相比，损伤后 2~6 h 肉眼可见损伤处骨骼肌肿 胀明显，水肿和出血严重，骨骼肌与周围皮肤粘连；镜 下见损伤区组织松散，骨骼肌间质内可见血管充盈， 中性粒细胞向损伤区迁移，部分血管断裂，骨骼肌细 胞排列紊乱，细胞破裂，胞核碎裂、溶解，胞质内及细 胞周围可见炎症细胞浸润。 2.2 有效细胞核和中性粒细胞实际阳性率 从图 1 可知，对照组组织切片中可见大量苏木素 着色的骨骼肌细胞核，通过软件设置，骨骼肌细胞核 被标识为绿色。损伤后 2~6 h，损伤区的中性粒细胞 （红色标识）浸润明显，伤后2 h中性粒细胞较少，伤后 4 h最多，伤后6 h又减少。 TissueFAXS PLUS 软件统计有效细胞核和中性 粒细胞结果（图 2）显示：对照组有效细胞核的比例为 （84.54±6.33）%，损伤后 2~6 h，分析区内有效细胞核 比例明显下降，伤后 2 h 为（74.87±6.06）%，伤后 4 h 为 （71.05±2.04）%，伤后 6 h 为（51.11±4.68）%。对细胞 核进行分析，可见核面积小于42 μm2 的细胞在对照组 中的比例为（15.45±3.12）%，伤后 2 h 比例为（25.09± 3.43）%，伤后 4 h 比例为（28.45±2.02）%，伤后 6 h 比例 为（41.97±0.63）%。伤后 6 h 组中，仅苏木素染色强度 低于对照组的比例为（7.92±0.91）%，仅核面积小于对 照组的比例为（23.09±1.50）%，染色强度低且核面积 小的比例为（17.88±1.37）%。 对照组分析区内的中性粒细胞比例仅为（2.50± 1.04）%，伤后 2 h 上升至（13.50±1.25）%，伤后 4 h 达到 峰值（31.12±2.29）%，伤后6 h下降至（14.13±1.42）%。 A B C D A：对照组；B：伤后2 h组；C：伤后4 h组；D：伤后6 h组 图1 大鼠骨骼肌组织的MPO免疫组织化学染色结果（×200） A、B：对照组；C、D：伤后2 h组；E、F：伤后4 h组；G、H：伤后6 h组；A、C、E、G为苏木素染色；B、D、F、H为免疫组织化学染色 图2 大鼠骨骼肌损伤后有效细胞核和中性粒细胞比例的组织细胞定量分析结果 A B C D E F G H · 168 · 万方数据法 医 学 杂 志 2019年 4月 第35卷 第2期 损伤区域单位面积内有效细胞核及中性粒细胞 数量、比例如表 1 所示。结果表明，骨骼肌组织在未 损伤时中性粒细胞极少，在本研究中比例仅为（4.43± 0.68）%，但假阳性率使其实际比值有所增加。伤后 2 h出现中性粒细胞浸润，阳性率为（28.75±0.94）%，之 后数量进一步增加，在 4 h 达到峰值，比例为（45.50± 3.63）%，随着炎症过程进展，中性粒细胞浸润程度逐 渐降低，至伤后 6 h 其阳性率为（31.92±1.56）%。结合 上述数据并划分区间：损伤后 2 h 中性粒细胞实际阳 性率<30%，伤后 4 h 阳性率>40%，伤后 6 h 阳性率为 30%~40%。 2.3 中性粒细胞迁移距离 从图 3 可见，损伤后 2~6 h，中性粒细胞逐渐向 损伤区迁移：伤后 2 h 中性粒细胞平均迁移距离为 （124.80±12.32）μm，伤后 4 h 为（229.03±21.45）μm， 伤后6 h为（335.04±16.75）μm，组间两两比较差异有统 计学意义（P<0.05）。平均迁移距离随损伤时间呈现规 律性变化。根据上述数据可划分区间：损伤后2 h中性 粒细胞平均迁移距离<200 μm，伤后4 h平均迁移距离 为200~300μm，伤后6 h平均迁移距离为300~400μm。 表1 大鼠骨骼肌损伤后有效细胞核和 中性粒细胞数的变化 （n=5，x±s） 组别 对照 伤后2 h 伤后4 h 伤后6 h 有效细胞核数/ （个/mm2 ） 854.23±59.09 1 277.40±102.44 1 110.01±82.23 987.03±83.47 中性粒细胞数/ （个/mm2 ） 38.39±5.46 366.20±38.35 506.77±22.51 312.42±20.13 中性粒细胞 实际阳性率/% 4.43±0.68 28.75±0.94 45.50±3.63 31.92±1.56 注：各组间数据两两比较，P均<0.05 A：伤后2 h组；B：伤后4 h组；C：伤后6 h组 图3 大鼠骨骼肌损伤后中性粒细胞的有效迁移距离（MPO免疫组织化学染色×100） A B C 3 讨 论 挫伤是日常生活中最常见的一类机械性损伤，其 损伤时间推断是法医病理学研究热点和难点之一[8] 。 损伤时常伴随骨骼肌挫伤，骨骼肌因不容易受外部环 境污染、自溶较慢、患病率低、取材方便等，可作为研 究损伤时间推断的良好检材[9] 。骨骼肌挫伤后，局部 可出现红、肿、热、痛和功能障碍。在炎症反应的早期 （24 h 内），中性粒细胞以阿米巴运动的方式首先从血 管渗出,并在趋化因子的诱导下向损伤部位定向迁 移。有研究[10] 报道，骨骼肌损伤后 3 h 就可分泌血小 板衍生因子、成纤维细胞生长因子，趋化中性粒细胞 浸润到骨骼肌损伤区，吞噬坏死组织。中性粒细胞具 有活跃的吞噬功能，含有酸性磷酸酶、过氧化物酶、碱 性磷酸酶和溶菌酶等，可消化分解吞噬的异物，自身 也常坏死，成为脓细胞；且中性粒细胞在静息时就可 发生凋亡，3 d 时凋亡率已达 94.3%[11] 。有研究[4] 显示， 骨骼肌挫伤后 6~12 h 中性粒细胞浸润明显，伤后 1 d 浸润程度降低，3 d 明显降低，之后消失。本研究结果 也显示,骨骼肌损伤后中性粒细胞阳性率呈现先升高 后降低的趋势，且在损伤后 2~6 h 即发现中性粒细胞 明显浸润，进一步明确了中性粒细胞浸润时限。人体 白细胞浸润一般需要 4~6 h[12] ，本研究发现，大鼠在肌 肉挫伤后 2 h 即有中性粒细胞浸润，分析其原因可能 为：（1）随着检测仪器和技术的进步，使得原先未被检 测到的中性粒细胞得以被检测出来；（2）白细胞浸润 时间可能与种属、组织类型、损伤类型、损伤程度等情 况有关；（3）大鼠的繁殖能力比人类强、生长速度比人 类快，损伤后炎症反应速度可能更快，组织修复能力 可能更强。 本研究注意到，与对照组相比，损伤后 2~6 h 有 效细胞核的比例逐渐降低，而苏木素着色面积小于 42 μm2 的细胞核逐渐增多。这可能与骨骼肌细胞损 伤坏死后出现核固缩、核碎裂、核溶解过程有关，导致 核面积减小。进一步分析发现，对于伤后 6 h，不仅苏 木素着色面积小于正常值的核增多，着色强度小于正 常值的核也明显增多，这说明核固缩、碎裂、溶解与细 胞坏死导致苏木素着色能力降低的双重影响共同拉 低了该时间点有效细胞核的比例。 · 169 · 万方数据Journal of Forensic Medicine, April 2019, Vol.35, No.2 中性粒细胞的渗出是一个随时间推演呈现由近 及远的动态过程。事实上，这些细胞具体由哪根血管 渗出无从知晓，但对损伤时间推断而言并无影响。根 据直线距离对中性粒细胞到达损伤区发挥功能有现 实意义，我们提出“有效迁移距离”的简化模型，探究 其在损伤时间推断上的应用价值。 随着炎症进程的发展，中性粒细胞从血管渗出并 向坏死部位定向趋化移动。这种趋化移动表现出明 显的规律性，具体体现在炎症早期中性粒细胞迁移距 离随时间的规律性变化，损伤后 2~6 h 中性粒细胞平 均迁移距离随损伤时间延长不断增加，其吞噬和清除 坏死组织的效能随迁移距离逐渐延伸。损伤后 2~6 h 中性粒细胞平均迁移距离随损伤时间的规律性变化， 有望用于骨骼肌损伤时间推断的研究，为后续实验提 供了新型研究方法。 骨骼肌损伤部位是相对局限的范围，中性粒细胞 渗出后发挥效能的区域也应该是以损伤区为主，因 此，中性粒细胞在到达目的区域后即停止游走，迁移 距离可能不再随损伤时间延长继续增加。基于此种 设想，“有效迁移距离”在早期损伤时间推断上具有应 用价值，而在晚期损伤时间推断上可能意义不大。后 续实验将至少增加损伤后 12、24、48 h 等时间点以丰 富早期损伤时间中性粒细胞阳性率和有效迁移距离 的数据，优化早期损伤时间推断的时间窗口。本研究 发现，中性粒细胞阳性率和有效迁移距离在损伤后 2~6 h 均呈现规律性变化，且组间差异具有统计学意 义，同时结合两者可能更有利于提高损伤时间推断 的准确性。当中性粒细胞阳性率<30%、平均迁移距 离<200 μm 时，提示大鼠骨骼肌损伤后 2 h；当中性粒 细胞阳性率>40%、平均迁移距离为 200~300 μm 时， 提示大鼠骨骼肌损伤后 4 h；当中性粒细胞阳性率为 30%~40%、平均迁移距离为 300~400 μm 时，提示大 鼠骨骼肌损伤后6 h。 参考文献： [1] TIDBALL J G. Mechanisms of muscle injury，repair，and regeneration[J]. Compr Physiol，2011，1（4）： 2029-2062. [2] KLEBANOFF S J. Myeloperoxidase[J]. Proc Assoc Am Physicians，1999，111（5）：383-389. [3] LAU D， MOLLNAU H， EISERICH J P， et al. Myeloperoxidase mediates neutrophil activation by association with CD11b/CD18 integrins[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（2）：431-436. [4] 于天水，官大威，赵锐，等. 大鼠骨骼肌损伤后中性粒 细胞、巨噬细胞和肌成纤维细胞数量分析研究[J]. 中 国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（6）：457-461. [5] SUN J H， ZHU X Y， DONG T N， et al. An “up， no change， or down” system： Time- dependent expression of mRNAs in contused skeletal muscle of rats used for wound age estimation[J]. Forensic Sci Int，2017，272：104-110. [6] SUN J H，NAN L H，GAO C R，et al. Validation of reference genes for estimating wound age in contused rat skeletal muscle by quantitative real-time PCR[J]. Int J Legal Med，2012，126（1）：113-120. [7] 百茹峰，吕小娇，鄂晓霏，等. 不同高度钝力打击致大鼠 皮肤与骨骼肌挫伤的对比[J].法医学杂志，2017，33（1）： 1-5. [8] 杜秋香，程晓花，朱细燕，等. 双内参基因用于大鼠挫 伤肌肉 TAB2 mRNA 表达量检测[J]. 中国法医学杂 志，2016，31（3）：231-234. [9] 张镭. 大鼠肌肉挫伤后肌钙蛋白 I mRNA 表达与损 伤时间关系的研究[D].太原：山西医科大学，2009. [10] ROBERTSON T A，MALEY M A，GROUNDS M D，et al. The role of macrophages in skeletal muscle regeneration with particular reference to chemotaxis[J]. Exp Cell Res，1993，207（2）：321-331. [11] AOSHIBA K， YASUI S， HAYASHI M， et al. Role of p38- mitogen- activated protein kinase in spontaneous apoptosis of human neutrophils[J]. J Immunol，1999，162（3）：1692-1700. [12] 李玉林，文继舫，唐建武. 病理学[M].7版.北京：人民 卫生出版社，2008. （收稿日期：2017-04-27） （本文编辑：黄平） · 170 · 万方数据